当细胞或组织被裂解时，内源性蛋白酶和磷酸酶便会释放出来。一旦条件适宜，它们会迅速降解目标蛋白或其重要修饰状态。

蛋白酶会水解蛋白质肽键，导致目标蛋白被切割，在WB中表现为条带变弱、出现杂带或完全消失；磷酸酶则会催化磷酸化蛋白的去磷酸化，使磷酸化蛋白无法被检测。

因此，在蛋白提取过程中添加酶抑制剂，是维持蛋白质完整性与修饰状态的关键，也是WB实验成功的基础。

酶抑制剂主要通过干扰酶的活性中心或结构，阻止其催化反应。根据其抑制的目标酶类型和具体的作用机制，可进行如下分类：

2.1 按抑制目标分类

蛋白酶抑制剂：用于防止蛋白质被降解。

磷酸酶抑制剂：用于维持蛋白质的磷酸化修饰状态。

2.2 按作用机制分类

理解这一层次，有助于预测试剂的特异性、可逆性和使用条件。

2.2.1 蛋白酶抑制剂的作用机制

主要通过共价或非共价方式，作用于蛋白酶的活性位点。

   ● 不可逆抑制：抑制剂与酶活性中心的必需基团形成稳定的共价键，使酶永久失活。

例如：PMSF（苯甲基磺酰氟） 是一种不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂。它特异性地与丝氨酸蛋白酶活性中心的丝氨酸羟基共价结合，使其永久失活。因其在水溶液中不稳定，需现用现加。

  ● 可逆抑制：抑制剂通过非共价键（如离子键、氢键）与酶结合，结合与解离处于动态平衡中。

       »竞争性抑制：抑制剂与底物结构相似，竞争结合酶的同一活性中心。

       »非竞争性抑制：抑制剂结合在酶活性中心以外的部位，通过改变酶构象来抑制活性。

例如：EDTA（乙二胺四乙酸） 是一种金属离子螯合剂，属于可逆的非竞争性抑制剂。它通过螯合金属蛋白酶活性所必需的金属离子（如Zn²⁺、Ca²⁺），间接抑制酶活性。因其作用依赖于螯合反应，在碱性（pH 8-9）条件下溶解和螯合效果更佳。

2.2.2 磷酸酶抑制剂的作用机制

主要模拟磷酸化反应的过渡态或产物，干扰去磷酸化过程。

  ● 竞争性抑制：抑制剂模拟磷酸化蛋白的磷酸基团，竞争性地占据磷酸酶的活性中心。

例如：正钒酸钠（Sodium Orthovanadate） 在活化后形成原钒酸盐，其结构与磷酸盐的过渡态类似，可竞争性抑制酪氨酸磷酸酶和碱性磷酸酶。

  ● 非竞争性/不可逆抑制：抑制剂与酶活性中心的必需组分结合，导致酶失活。

例如：氟化钠（Sodium Fluoride） 可与磷酸酶活性中心的镁离子形成难溶的氟磷酸镁复合物，非竞争性且不可逆地抑制酸性磷酸酶的活性。

2.3 常用抑制剂速查表

竞争性抑制剂的效果取决于其与底物的浓度比，增加底物浓度可降低抑制效果。

不可逆抑制剂一旦起作用，效果是持久的，稀释不能恢复酶活。

在实际应用中，由于裂解液中蛋白酶/磷酸酶种类复杂，推荐使用广谱的复合抑制剂混合物，以提供全面保护。

面对多种抑制剂，考虑实验需求，合理选择是关键：

1. 是否检测蛋白磷酸化：若仅检测总蛋白，添加蛋白酶抑制剂即可；若需检测蛋白磷酸化，则必须同时添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。

2. 使用蛋白酶抑制剂混合液：由于不同蛋白酶对抑制剂的不同，且细胞或组织中存在的蛋白酶类型多样，使用复合型蛋白酶抑制剂混合物通常是更有效、更便捷的选择，它们能提供更广泛的保护。

3. 注意抑制剂的溶解性和稳定性：许多抑制剂水溶性差或在水中不稳定。例如PMSF在水溶液中半衰期很短，需在裂解前新鲜加入。应严格按照产品说明配制和保存。

4. 考虑下游应用：如果后续实验涉及金属螯合亲和层析，应使用不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物。

1. 提前加入：酶抑制剂应在裂解前加入至裂解液中，确保在细胞或组织裂解的第一时间就起效。

2. 低温操作：整个蛋白提取过程应在低温环境下进行，进一步降低酶活性。

3. 新鲜配制：对水溶液中不稳定的抑制剂（如PMSF），必须保证每次实验都新鲜添加。

4. 避免反复冻融：商品化的抑制剂混合物储存液应分装保存，避免反复冻融导致活性降低。

5. 正确保存：严格按照产品说明书的要求保存抑制剂，如片剂抑制剂通常可在4℃保存，而溶液型抑制剂往往需要-20℃保存。