PCR (Polymerase Chain Reaction) 法是一种体外扩增DNA的方法。因其操作简单，成本低，兼容性强等特点，已成为分子生物学的基础工具，应用已渗透至生命科学的各个领域。
然而室温下Taq DNA聚合酶具有残留活性，会导致引物与模板非特异性结合，容易形成引物二聚体和错配的非特异性扩增产物，进而影响到目标核酸的扩增效率。
Hot Start PCR法的出现动机源于解决常规PCR在室温配制反应体系时发生的非特异性扩增问题，其核心原理是通过温度依赖性抑制DNA聚合酶活性，确保扩增反应仅在高温下启动。
Hot Start PCR法的演化
通过物理、化学或生物手段在PCR循环前抑制DNA聚合酶活性，直至高温激活阶段释放酶活，实现"低温封锁-高温激活"的精准控制，从而降低了非特异性扩增，提高靶标核酸的扩增效率，降低假阳性出现的概率。
图示 不同的抑制酶活性的方案
阶段1 早期手动热启动方案
早期的学者为了解决非特异扩增的问题，通过蜡层隔离酶和反应液，然后通过高温熔化使得试剂混合。存在耗时，操作复杂，容易污染等问题。
阶段2 化学修饰
利用酸酐等化学小分子修饰DNA聚合酶上的赖氨酸残基，从而在常温下抑制DNA聚合酶的活性。存在高温激活时间长等问题。
阶段3 抗体修饰
单封闭抗体或双封闭抗体会通过结合酶活性中心形成空间位阻抑制活性。抗体在PCR反应初始热激活步骤中变性并分离，从而使 Taq DNA 聚合酶发挥作用。由于抗体对热极为敏感，因此抗体抑制酶的激活时间短，通常需要20s~5min即可完成。
阶段4 适配体修饰
核酸适配体可逆结合酶活性中心位置抑制其功能。可在相对较低的温度进行解离，释放Taq酶活性。适配体修饰需依赖修饰核苷酸技术和高通量筛选平台，面临筛选成本高，稳定性差等挑战。
综上所述，Hot Start PCR法的诞生动机直指常规PCR的室温活性残留问题，其本质是通过温度依赖性开关机制重塑酶活性的时空控制。总体而言，热启动 DNA 聚合酶不仅广泛应用于传染病领域，而且还广泛应用于其他行业，例如法医学、环境监测或基因测试。
随着分子诊断的不断发展，引物探针全预混试剂以方便快捷的优势成为热门需求。然而传统Taq酶抗体原料通常仅封闭Taq酶的聚合活性，其5'-3'外切酶活性仍然暴露，导致与探针混合后，在低温下仍发生探针切割释放信号，造成假阳性的问题。
为了解决上述问题，近岸蛋白特别推出双活性封闭的Taq酶抗体（目录号：Z088），与Taq DNA Polymerase 结合后，能够同时高效封闭其5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，从而抑制低温条件下由引物的非特异性退火引起的非特异性扩增，和探针切割造成的假阳性，从而支持引物探针、酶以及Buffer等全预混qPCR/qRT-PCR体系的搭建。
产品特点
1）高特异性：与Taq 酶亲和力高，有效避免非特异性扩增；
2）热启动迅速：95 ℃、30s即可启动Taq酶活性；
3）支持全预混：可将除模板以外的所有组分预混成一管，使用便捷高效；
4）适用范围广：适配野生型及多种突变型Taq酶的封闭。
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产品性能
1 双活性封闭性能优
将带有荧光标记的模板分别与未封闭、单封闭抗体以及双封闭抗体的Taq酶混合，50℃实时检测荧光值变化。结果显示，双封闭抗体能够很好的封闭Taq酶的5' - 3'聚合酶活性以及5' - 3'外切酶活性。同时使用双封闭抗体，品牌A和品牌B同类产品分别封闭Taq DNA聚合酶，检测封闭效果。结果显示，近岸蛋白产品的封闭效果优于品牌A和品牌B。
图示1. 不同活性位点封闭效果测试
图示2. 封闭效果验证
2 酶活释放快
使用5U/ul 双抗体封闭Taq DNA聚合酶，95℃下热启动30s。结果显示酶活释放速度快，95℃，30 s即可释放酶活，不影响后续扩增。
图示3. 酶活释放效果测试
3 适配全预混
使用单封闭抗体，双封闭抗体分别封闭Taq DNA聚合酶，混合ASFV的引物探针制备成全预混试剂，在37℃放置7d后，分别扩增2000拷贝，200拷贝和20拷贝ASFV质粒。结果显示，双封闭抗体全预混的基线更平稳，扩增平台值更优，且37℃稳定性强，与-20℃保存试剂扩增无明显差异。
图示4. 不同抗体封闭的全预混效果测试
4 稳定性强
使用热加速破坏性试验测试双封闭抗体的稳定性。在37℃放置2d、5d、7d和14d，通过荧光法检测发现双封闭抗体（Z088）在14d封闭效果表现优异，稳定性更高。
图示5. 双封闭抗体稳定性测试
5 适用范围广
使用双封闭抗体分别封闭野生型和突变型TaqDNA 聚合酶，通过荧光法检测封闭效果。结果显示，对于不同类型的Taq酶，近岸蛋白双封闭抗体封闭效果表现优异。
图示6. 双封闭抗体适配不同类型的Taq酶
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